Физико-химические свойства Δ3−12 цистеин-обедненного цитохрома P450 3A4 с аминокислотной заменой S291C

Бритиков В. В.; Бритикова Е. В.; Бочаров Э. В.; Бершацкий Я. В.; Кузьмина Н. В.; Бойко К. М.; Усанов С. А.

Физико-химические свойства Δ3−12 цистеин-обедненного цитохрома P450 3A4 с аминокислотной заменой S291C

Бритиков В. В., Бритикова Е. В., Бочаров Э. В., Бершацкий Я. В., Кузьмина Н. В., Бойко К. М., Усанов С. А.

2022

https://doi.org/10.29235/1561-8323-2022-66-2-176-186

Цитохром P450 3A4 (3A4) экспрессируется в клетках печени человека и играет ключевую роль в метаболизме ксенобиотиков, в том числе и более 50 % лекарственных препаратов. Регуляция активности данного фермента может происходить на уровне экспрессии генов, а также на уровне конформационного состояния структуры самого белка, за счет изменения молекулярного окружения, в том числе за счет взаимодействия с высокомолекулярными эффекторами. Понимание изменения структуры и динамики 3A4 в ответ на изменение условий среды необходимо для предсказания изменения уровня его активности, который в значительной степени обуславливает гомеостаз организма. Для проведения in vitro экспериментов по исследованию структуры, динамики и белоклигандных/белковых взаимодействий ферментов современными спектральными методами используется подход, в котором в целевой белок селективно вводятся методами белковой инженерии цистеиновые остатки в заданные локусы полипептидной цепи для последующего мечения специализированными молекулярными метками. Для этих целей в данной работе была получена мутантная форма мембрансвязанного (полноразмерного) рекомбинантного цитохрома P450 3A4 человека C58A/C64M/C98A/C239T/C377A/C468S/S291C. По данным спектроскопии кругового дихроизма нами было установлено, что введенные мутации не вызывают значимых изменений во вторичной структуре полученной формы 3A4, что свидетельствует о сохранении свернутости полипептидной цепи. Проведены спектрофотометрические измерения для сравнительного анализа изменения сродства к лигандам активного центра. Более того, нами было показано, что тестостерон гидроксилирующая активность в in vitro реконструированной системе для данной мутантной формы 3A4 многократно увеличивается относительно дикой формы фермента.

Бритиков В. В., Бритикова Е. В., Бочаров Э. В., Бершацкий Я. В., Кузьмина Н. В., Бойко К. М., Усанов С. А. Физико-химические свойства Δ3−12 цистеин-обедненного цитохрома P450 3A4 с аминокислотной заменой S291C. Доклады Национальной академии наук Беларуси. 2022;66(2):176-186. https://doi.org/10.29235/1561-8323-2022-66-2-176-186

Цитирование

Список литературы

1. Guengerich, F. P. Human cytochrome P450 enzymes / F. P. Guengerich // Cytochrome P450. – Springer, Cham, 2015. – P. 597–607.

2. The structure of human microsomal cytochrome P450 3A4 determined by X-ray crystallography to 2.05-Å resolution / J. K. Yano [et al.] // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, N 37. – P. 38091–38094. https://doi.org/10.1074/jbc.c400293200

3. Ekroos, M. Structural basis for ligand promiscuity in cytochrome P450 3A4 / M. Ekroos, T. Sjögren // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2006. – Vol. 103, N 37. – P. 13682–13687. https://doi.org/10.1073/pnas.0603236103

4. Sevrioukova, I. F. Dissecting cytochrome P450 3A4–ligand interactions using ritonavir analogues / I. F. Sevrioukova, T. L. Poulos // Biochemistry. – 2013. – Vol. 52, N 26. – P. 4474–4481. https://doi.org/10.1021/bi4005396

5. Structure-based ligand design to overcome CYP inhibition in drug discovery projects / G. Brändén [et al.] // Drug Discovery Today. – 2014. – Vol. 19, N 7. – P. 905–911. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2014.03.012

6. Sevrioukova, I. F. Anion-dependent stimulation of CYP3A4 monooxygenase / I. F. Sevrioukova, T. L. Poulos // Biochemistry. – 2015. – Vol. 54, N 26. – P. 4083–4096. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.5b00510

7. Membrane-attached mammalian cytochromes P450: An overview of the membrane’s effects on structure, drug binding, and interactions with redox partners / M. Šrejber [et al.] // J. Inorg. Biochem. – 2018. – Vol. 183. – P. 117–136. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2018.03.002

8. Hackett, J. C. Membrane-embedded substrate recognition by cytochrome P450 3A4 / J. C. Hackett // J. Biol. Chem. – 2018. – Vol. 293, N 11. – P. 4037–4046. https://doi.org/10.1074/jbc.ra117.000961

9. Site‐specific labelling of proteins with a rigid lanthanide‐binding tag / X. C. Su [et al.] // ChemBioChem. – 2006. – Vol. 7, N 10. – P. 1599–1604. https://doi.org/10.1002/cbic.200600142

10. A Chiral Lanthanide Tag for Stable and Rigid Attachment to Single Cysteine Residues in Proteins for NMR, EPR and Time‐Resolved Luminescence Studies / I. D. Herath [et al.] // Chemistry – A European Journal. – 2021. – Vol. 27, N 51. – P. 13009–13023. https://doi.org/10.1002/chem.202101143

11. Site-specific fluorescent labeling and oriented immobilization of a triple mutant of CYP3A4 via C64 / A. Ménard [et al.] // Bioconjugate Chemistry. – 2012. – Vol. 23, N 4. – P. 826–836. https://doi.org/10.1021/bc200672s

12. Polic, V. Allosteric activation of cytochrome P450 3A4 via progesterone bioconjugation / V. Polic, K. Auclair // Bioconjugate Chemistry. – 2017. – Vol. 28, N 4. – P. 885–889. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.6b00604

13. Sevrioukova, I. F. High-level production and properties of the cysteine-depleted cytochrome P450 3A4 / I. F. Sevrioukova // Biochemistry. – 2017. – Vol. 56, N 24. – P. 3058–3067. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.7b00334

14. Mechanism of interactions of α-naphthoflavone with cytochrome P450 3A4 explored with an engineered enzyme bearing a fluorescent probe / T. N. Tsalkova [et al.] // Biochemistry. – 2007. – Vol. 46, N 1. – P. 106–119. https://doi.org/10.1021/bi061944p

15. Effect of glutathione on homo-and heterotropic cooperativity in cytochrome P450 3A4 / D. R. Davydov [et al.] // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 2008. – Vol. 471, N 2. – P. 134–145. https://doi.org/10.1016/j.abb.2008.01.001

16. Peripheral ligand-binding site in cytochrome P450 3A4 located with fluorescence resonance energy transfer (FRET) / D. R. Davydov [et al.] // J. Biol. Chem. – 2012. – Vol. 287, N 9. – P. 6797–6809. https://doi.org/10.1074/jbc.m111.325654

17. A large-scale allosteric transition in cytochrome P450 3A4 revealed by luminescence resonance energy transfer (LRET) / E. V. Sineva [et al.] // PLoS One. – 2013. – Vol. 8, N 12. – Art. e83898. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083898

18. Interactions among cytochromes P450 in microsomal membranes: oligomerization of cytochromes P450 3A4, 3A5, and 2E1 and its functional consequences / D. R. Davydov [et al.] // J. Biol. Chem. – 2015. – Vol. 290, N 6. – P. 3850–3864. https://doi.org/10.1074/jbc.m114.615443

19. Conformational mobility in cytochrome P450 3A4 explored by pressure-perturbation EPR spectroscopy / D. R. Davydov [et al.] // Biophys. J. – 2016. – Vol. 110, N 7. – P. 1485–1498. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2016.02.026

20. Porath, J. Immobilized metal affinity adsorption and immobilized metal affinity chromatography of biomaterials. Serum protein affinities for gel-immobilized iron and nickel ions / J. Porath, B. Olin // Biochemistry. – 1983. – Vol. 22, N 7. – P. 1621–1630. https://doi.org/10.1021/bi00276a015

21. Morrison, J. F. Kinetics of the reversible inhibition of enzyme-catalysed reactions by tight-binding inhibitors / J. F. Morrison // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. – 1969. – Vol. 185, N 2. – P. 269–286. https://doi.org/10.1016/0005-2744(69)90420-3

22. Expression of modified human cytochrome P450 3A4 in Escherichia coli and purification and reconstitution of the enzyme / E. M. J. Gillam [et al.] // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 1993. – Vol. 305, N 1. – P. 123–131. https://doi.org/10.1006/abbi.1993.1401

23. AMBER16 package / D. A. Case [et al.]. – San Francisco, 2016.

24. CHARMM‐GUI: a web‐based graphical user interface for CHARMM / S. Jo [et al.] // J. Comp. Chem. – 2008. – Vol. 29, N 11. – P. 1859–1865. https://doi.org/10.1002/jcc.20945

25. Frank, D. J. Analysis of heterotropic cooperativity in cytochrome P450 3A4 using α-naphthoflavone and testosterone / D. J. Frank, I. G. Denisov, S. G. Sligar // J. Biol. Chem. – 2011. – Vol. 286, N 7. – P. 5540–5545. https://doi.org/10.1074/jbc.m110.182055

Источник

Информация

Автор

Бритиков В. В. Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси
Бритикова Е. В. Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси
Бочаров Э. В. Институт биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук
Бершацкий Я. В. Институт биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук
Кузьмина Н. В. Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук
Бойко К. М. Институт физической химии и электрохимии имени А. Н. Фрумкина Российской академии наук
Усанов С. А. Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси

Страницы

176-186

Год издания

2022

Ключевые слова

Коллекции

Доклады Национальной академии наук Беларуси